灵芝（Ganoderma lucidum）是我国传统的药用真菌，是在全球范围内用于促进健康的滋补品，可用于处理疲劳，免疫失调以及癌症。已有的研究揭示了灵芝和多糖提取物的免疫增强作用，其活性可能与肠道微生物菌群有关。灵芝孢子油（GLSO）也是广受大众熟知的灵芝产品之一，但目前关于GLSO的免疫促进活性及其潜在机制的研究还十分有限。

近日，在研究GLSO免疫增强特性的过程中，澳门大学中医药研究所中药质量研究国家重点实验室的科研人员利用微生物组和代谢组学，分析测定了灵芝孢子油的免疫增特性并有了新发现 。

研究结果表明：GLSO增强了小鼠的巨噬细胞吞噬作用和NK细胞的细胞毒性。进一步的微生物组和代谢组学研究表明，GLSO引起肠道微生物群的结构重排，介导了多种代谢产物的改变。此外，GLSO引起了一系列关键代谢产物的调节，例如多巴胺，脯氨酰-谷氨酰胺，五甲基甲硫氨酸，亮氨酰-谷氨酰胺，L-苏氨酸，硬脂酰肉碱，二硫代β-D-葡萄糖基磷酸酯等。这些结果为人们了解GLSO对免疫系统的调节作用提供了新的见解。实验结果揭示如下：

1、灵芝孢子油增强免疫力

研究人员通过紫外分光光度计测量得到GLSO中的总三萜含量为每克249mg，并且通过高效液相色谱法（HPLC）测得麦角固醇含量为0.7mg / g。随后，研究者研究了GLSO在小鼠中的免疫增强作用。在小鼠中使用的GLSO剂量（400-800 mg / kg）与建议的人类使用剂量相同。

图1.GLSO可增强小鼠的免疫力

连续27天（每天一次，口服）给药GLSO后，L和H组对体重得改变均无显著性差异。与对照组相比，给药组小鼠得脾和胸腺的形态保持正常（图1C），脾脏和胸腺的器官指数以及血液中白细胞的总数没有显著变化（图1D–F）。此外，与对照组相比，给药组的血清溶血素水平（HC50）没有显著变化（图1G）。然而，吞噬指数α（图1H）和脾淋巴细胞的细胞毒性活性（图1I）均有所增加。 

在脾细胞的细胞毒性测定中，将NK细胞敏感的YAC-1细胞用作靶细胞。结果表明GLSO增强了巨噬细胞的吞噬作用并促进了脾NK细胞的细胞毒性，显示了对细胞免疫的免疫增强作用。因此，以上研究的结果证实，GLSO具有显著的免疫增强效果，提高了小鼠的免疫能力，特别是在巨噬细胞吞噬作用和NK细胞毒性增加的情况下。

2、灵芝孢子油改变肠道菌群组成

给药21天后，研究者收集了小鼠的粪便样品，并对肠道微生物组进行了16S rRNA测序，以观察GLSO对肠道微生物组的影响。

图2.肠道微生物群落多样性与结构分析

结果表明，肠道微生物组的α多样性可能会降低（图2A–D），因为与对照组相比，GLSO_H组的 微生物多样性指标显著降低（图2B）。

此外，PCoA分析表明GLSO处理后肠道菌群的结构重排。图2F显示了在门分类水平的微生物群落的变化。有趣的是，与对照组小鼠相比，GLSO处理后的厚壁菌门相对丰度降低了，拟杆菌门/壁厚菌门的比率却显著提高。因此研究者认为，GLSO处理可响应导致营养不良的环境因素，并提高肠道微生物群落的适应性。

3灵芝孢子油特异性微生物的鉴定

如图3A所示，热图显示了30个主要属的平均丰度，表明肠道菌群组成发生了显著变化。乳酸杆菌，双歧杆菌，拟杆菌，Turicibacter和Romboutsia的相对水平显著增加。幽门螺杆菌和幽门螺杆菌的数量减少了（图3A），乳酸杆菌细菌均明显富集（图3B）。

图3 群体间的一般差异

此外，GLSO可以减少包括葡萄球菌，幽门螺杆菌和Lachnospiracea在内的属的丰度。 粪便微生物组中不同细菌之间的细菌丰富度差异很大，其中乳酸杆菌，肠杆菌，拟杆菌，酸性杆菌，轮状杆菌和Turicibacter明显富集。这些潜在健康的微生物可能是GLSO治疗提高免疫力的的重要特征。

图4 (A)20个最丰富的蚀变物种的三元图(点的大小表示相对丰度)

(B)线性判别分析(LDA)结合效果(LEfSe)。

4、对比粪便代谢组学中的肠道代谢

肠道微生物组与复杂的宿主微生物代谢轴相互作用。研究人员为了评估响应GLSO诱导的肠道菌群变化的代谢变化，以揭示GLSO处理的小鼠的代谢模式。由于仅高剂量的GLSO（800 mg / kg）显示出显著的免疫增强作用，因此研究者仅在高剂量的GLSO处理的小鼠中进行了代谢组学研究。

图5 粪便代谢组学测定对照组和给药组的代谢物(n = 10)

(A) 火山图显示GLSO组代谢物的积累和变化较对照组具有显著性差异。

(B) 基于代谢产物改变的PLS-DA图。(C) 基于代谢物变化的通路富集

研究结果显示，从阴性和阳性模式中总共鉴定出948种代谢产物。火山图结果表明，在对照组和给药组中，从阴性和阳性模式鉴定出的粪便代谢产物的分布存在显著差异。GLSO处理后，苏氨酸代谢显著富集（图5C），其中直接涉及10种代谢物。主要富集的途径与氨基酸代谢有关。

5、灵芝孢子油代谢产物的鉴定

为了进一步鉴定与GLSO介导的代谢组学改变相关的关键代谢物，研究者进行了生物标记分析。

图6 鉴定标记代谢物的生物标记物分析和热图

(A)使用15个变量的生物标志物模型预测所有样本的类概率。

（B）所选模型中最重要的25个特征的图表，依次为从最重要到最不重要。

（C）基于来自生物标志物分析和途径分析的选定标志物代谢物的所有样品的热图。

所有样品的预测分类概率表明对照组和用药组之间的分类较好（图6A）。图6B显示了25种最重要的生物标记物，包括多巴胺，3-甲基腺嘌呤，戊酸蛋氨酸，硬脂酰肉碱，亮氨酰谷氨酰胺，瓜氨酸，二硫代β-D葡糖基磷酸，鸟氨酸，L-苏氨酸，亮氨酰天冬酰胺等。根据鉴定出的生物标志物以及参与富集途径的代谢物，热图分析表明对照组和GLSO处理组的代谢模式完全不同（图6C）。GLSO处理后，大多数代谢物改变，以及与免疫调节有关的证据表明，肠道微生物代谢轴对于GLSO在小鼠中的免疫增强作用至关重要。

6、灵芝孢子油免疫增强作用的关键特征

基于上述粪便微生物组和代谢组学数据，研究者随后进行了Pearson的相关分析，以鉴定GLSO治疗后与免疫促进相关的微生物和代谢产物。 如图7所示，吞噬指数和NK活性与乳酸杆菌和轮状杆菌的丰度增加以及葡萄球菌的减少显著相关。

图7 吞噬指数、NK活性、关键代谢物和变异微生物之间的Pearson相关性分析正相关显示为红色，负相关显示为绿色。

显著性表示为：* p<0.05，**p <0.01，*** p <0.001。

L. intestinalis和 L. reuteri与NK细胞活性呈正相关。乳杆菌属与多巴胺，脯氨酰谷氨酰胺，五亚甲硫氨酸，亮氨酰谷氨酸，L-苏氨酸，N6-β-天冬氨酰赖氨酸和L-精氨酸呈正相关，与硬脂酰肉碱，二硫代β-D-葡萄糖基磷酸酯呈负相关，反式-哌啶，肌酸，高香草酸和3-甲氧基-4-羟基苯基乙二醇。葡萄球菌与原卟啉原IX以及肌酸有正相关。吞噬指数和NK活性也与大多数标记代谢物高度相关。因此，研究者认为GLSO的免疫增强作用与微生物代谢轴的特异性改变有关。

结论

研究调查了高价值的膳食补充剂灵芝孢子油（GLSO）的免疫增强作用。其中800 mg / kg用药组显著增强了ICR小鼠的先天免疫和细胞免疫。进一步的微生物组和代谢组学研究表明，GLSO诱导了肠道菌群的结构重排，介导了多种代谢物的改变。研究发表在药理学界主流杂志《药理学研究》(Pharmacological research)上，为人们了解GLSO对免疫系统的调节作用提供了新见解。

文章来源：
Xu Wu, Jiliang Cao, Mingxing Li, et al. An integrated microbiome and metabolomic analysis identifies immunoenhancing features of Ganoderma lucidum spores oil in mice. 2020, 158